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影响高效毛细管电泳色谱仪谱峰展宽的因素.【新闻】

2022年08月05日 贵阳机械设备网

影响高效毛细管电泳色谱仪谱峰展宽的因素

影响高效毛细管电泳色谱仪(CE)谱峰展宽的因素有进样、纵向扩散、焦耳热、吸附、电分散和层流等。

一、进样:当进样塞长度太大时,引起的谱峰展宽大于纵向扩散,分离效率会明显下降。实际操作时,进样塞长度小于毛细管总长度的1%~2%。二、纵向扩散:扩散是物质分子由高浓度区域自发迁移到低浓度区域的过程。在理想的情况下,纵向扩散是CE中导致谱峰展宽的唯一因素。根据色谱速率理论方程可知:H = 2D/vap式中:D为组分的扩散系数。若只考虑分子扩散,则理论塔板数为:n = Lef/H= Lefvap/(2D)= apELef /(2D)= apVLef /(2DL)式中:V为电压,L为毛细管全长。由上式可知,n与电场强度成正比,与组分的扩散系数成反比。在CE中,组分在几万至十几万伏的电压下,迁移速度较快,纵向扩散小,柱效高。大分子比小分子的扩散系数小,可获得更高的分离效率。三、焦耳热:电流通过毛细管内缓冲溶液时产生的自热称为焦耳热。焦耳热通过管壁向周围环境散热,管中心温度较高,由中心向管壁逐渐下降。温度高,粘度小,管中心组分的迁移速度较快,管壁附近组分的迁移速度较慢,破坏了溶质区带的扁平塞子流型,造成谱峰展宽。大内径毛细电阻小,电流大,产生焦耳热多,且不易散热。小内径毛细管散热面积大,温度梯度小,谱峰展宽小。但内径过小会带来进样和检测等方面的困难,又易造成柱堵塞。因此,目前多采用内径为25~75m的毛细管。采用低淌度缓冲液如三羟甲基氨基甲烷(Tris)等,由于这种粒子的质荷比很大,可减小电流。采用温度控制装置,尽快除去热量,使系统尽可能保持恒温,是目前常采用的办法。控温方式有气冷和液冷,一般条件下用气冷可满足要求。四、吸附:溶质与毛细管壁之间存在吸附和疏水作用,会使迁移速度减慢,造成谱峰展宽。1、造成管壁吸附的主要原因:(1)阳离子溶质和带负电管壁的离子相互作用:当电解质溶液pH>3时,毛细管壁带负电荷,因静电引力,溶质阳离子被管壁吸附。(2)存在疏水相互作用:蛋白质和多肽带电荷数多,疏水基较多,疏水作用较强,被极性水溶剂挤向管壁,是目前分离该类物质的一大难题。在pH<3时,管壁呈电中性时尤为明显。小内径毛细管有利于散热,但比表面积大(柱内表面积和柱体积之比),会使吸附增加,峰展宽大。2、抑制或消除吸附的方法:(1)加入两性离子代替强电解质:两性离子一端带正电,另一端带负电,带正电一端与管壁负电中心作用,当浓度约为溶质的100~1000倍时,可抑制对蛋白质的吸附,又不增加溶液的电导,对电渗流影响不大。(2)采用极端pH条件:在pH = 2~3或pH>9的缓冲液中进行CE分离,可抑制管壁硅醇基的离解或使待测组分带负电,与管壁相斥,从而使吸附受到抑制。(3)对管壁加以修饰。五、电分散:当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时,会造成谱峰展宽。应尽量选择与样品淌度相匹配的背景电解质溶液。六、层流:一般情况下,CE中不存在层流,但当毛细管两端存在压力差时,会出现抛物线型的层流。产生的原因是毛细管两端液面高度不同。实际工作中,应保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。

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